抗日战争进入战略相持阶段后，日本政府对国民党进行军事打击为主转变为政治诱降为主，日军作战的主攻方向由对国民党的正面战场转向对共产党的敌后战场。随着日本对华政策的改变，国民党政府面对着共产党领导的抗日武装力量的壮大和抗日根据地的发展，其政策的重点也由对外转向了对内，实行消极抗日，积极反共的政策。1940年夏秋，国民党顽固派在华北发动的第一次反共高潮遭到失败后，便把反共中心转向华中，于1941年1月6日在安徽泾县茂林制造了震惊中外的皖南事变。
1月4日，奉命北移的新四军及其所属皖南部队9000余人，从云岭驻地出发往长江以北，在茂林地区突遭国民党军队7个师8万余人的包围袭击。英勇奋战的新四军经七昼夜激战，终因寡不敌众，弹尽粮绝，除约2000余人突出重围外，一部打散，大部壮烈牺牲和被俘。叶挺在同国民党谈判时被扣押，政治部主任袁国平牺牲，副军长项英、副参谋长周子昆在突围中被叛徒杀害。1月17日，蒋介石反诬新四军为“叛军”，宣布取消新四军番号，声称将叶挺交付“军法审判”，这就是以皖南事变为主要内容的第二次反共高潮。
国民党之所以敢这样做，与当时的国际形势有关。1940年6月，德军攻陷巴黎，法国贝当政府投降。9月，德、意、日三国在柏林缔结军事同盟条约，急谋结束中日战争，使日本从中国战场抽身，得以侵略南太平洋英美等国的殖民地。为此，德国再次出面调停，劝蒋介石集团对日妥协。这时，英美政府也改变了以牺牲中国利益来换取日本妥协的远东慕尼黑政策，积极拉拢蒋介石加入他们的联盟，以求遏制日本的南进。为了拉蒋，英国表示重开滇缅公路，美国宣布给以大量贷款。另外，苏联根据《中苏互不侵犯条约》继续给予国民党政府以军事和经济援助。国际上三大力量这样或拉、或诱、或授的结果，使蒋介石感到身价陡增，忘乎所以，好像历史给了他一个“解决共产党问题”的难得机会。
国民党顽固派发动第二次反共高潮，除了国际形势的变化使其有恃无恐外，还因为他们在苏北制造的反新四军摩擦中吃了亏，急切地要进行报复。在他们看来，苏北的地理位置介于华北与华中之间，是八路军与新四军联系的枢纽，占据苏北，可以阻止八路军与新四军会合。在苏北国民党的韩德勤部有16万之众，新四军陈毅部只有7千人。结果，仅9月底至10月初的黄桥一战，就被歼两个师1.1万多人。韩德勤在苏北反共受挫后，国民党顽固派加紧了压迫新四军北移的步伐。1940年10月19日，国民政府军事委员会正副参谋总长何应钦、白崇禧致电（即“皓电”）八路军朱德总司令、彭德怀副总司令和新四军叶挺军长，对中国共产党及其领导的武装力量进行种种攻击和诬蔑。要求在大江南北坚持抗战的八路军、新四军于一个月内全部开赴黄河以北，并将50万八路军、新四军合并缩编为10万人。面对蒋介石集团的压力，中共中央制定了对其实行“表面缓和，实际抵抗，有软有硬，针锋相对”的方针，经过毛泽东起草又反复思考，最后于11月9日以朱德、彭德怀、叶挺、项英名义复电（即“佳电”）何应钦、白崇禧，据实驳斥“皓电”的反共诬蔑和无理要求，同时表示，为顾全大局，团结抗战，新四军驻皖南部队将开赴长江以北。“佳电”是我党的严正宣言，对国民党当局晓以大义，用恳切之词，吐肺腑之言，是一篇针藏绵里，刚寓柔中，情理交融的杰作。大后方的民主人士无不为中共“佳电”既坚持大节又委屈求全的态度所感动。
但是，国民党当局把我之委屈求全、局部让步政策视为软弱可欺，于12月8日发出“齐电”，要八路军、新四军迅即“遵令”，将黄河以南的部队全部开赴黄河以北。9日，蒋介石签发手令，限长江以南的新四军丁12月31日以前开到长江以北，黄河以南的八路军、新四军于翌年1月30日以前开到黄河以北。10日，蒋又秘密下达《剿灭黄河以南匪军作战计划》和《解决江南新四军方案》，并密令第三战区司令长官顾祝同、第32集团军总司令上官云相等，调兵围歼新四军部队。
面对作为最后通牒的“齐电”和国民党军队的围歼部署，毛泽东和党中央决定我江南孤军迅即北移。12月中、下旬，毛泽东致电项英，皖南部队务须迅速渡江，作好应付突然事变的一切准备。12月26日，毛泽东以中央书记处名义电告项英等，指出“最近决定北移，至于如何北移，如何克服移动中的困难，要你们自己想办法，有决心”。12月31日，毛泽东代表中央书记处发出指示，对如何打破国民党顽固派的军事进攻作了全面部署。但项英则贻误战机，在中央12月26日指示的严厉批评后才仓促决定北移路线。这时，国民党早已完成围歼北移新四军的一切布置。结果，造成失败。
皖南事变发生后，毛泽东和党中央在延安，周恩来在重庆，刘少奇在盐城。1月20日，毛泽东以中央军委发言人名义发表谈话，揭露国民党当局的反共阴谋，抗议其武装袭击新四军的暴行，要求国民党当局取消1月17日的反动命令，惩办祸首，释放叶挺，废止国民党一党专政，实行民主政治。华北、华中各抗日根据地军民也纷纷集会，强烈声讨国民党顽固派的罪恶行经。同日，中央军委发布重建新四军军部的命令，任命陈毅为代理军长，刘少奇为政治委员，张云逸为副军长，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。1月25日，新四军新军部在苏北盐城成立，将全军整编为七个师一个独立旅，共9万余人，继续坚持在长江南北的抗战。周恩来领导南方局在重庆同国民党顽固派展开了坚决斗争，从政治上和宣传上进行猛烈反击。共产党的正义自卫立场，得到各界人士、民主党派的同情和支持。后来，中共参政员拒绝出席国民参政会第二次会议，提出承认中共及民主党派和陕甘宁边区的合法地位等，致使蒋介石在会上表示“以后再亦决无剿共的军事”。至此，第二次反共高潮被打退。