南方局是1938年9月26日中共中央政治局会议根据形势的变化决定设立的，1939年1月16日在重庆正式成立，周恩来任书记。南方局的任务是代表中共中央全面领导南方国民党统治区和部分沦陷区中共党的工作。
抗日战争期间，周恩来同志作为中国共产党的代表，经常前往国民党统治区的南京、武汉、重庆等地与国民党进行谈判。1938年10月党的六届六中全会期间，周恩来于10月1日抵达武汉。武汉失陷后，于12月中旬来到重庆主持南方局工作。由于国民党在各地制造的磨擦事件愈演愈烈，1939年6月18日周恩来离开重庆返回延安，研究解决办法。在延安期间因骑马跌伤后去苏联治病，于1940年2月25日乘火车经苏联阿拉木图，3月抵新缰，后乘苏民航班机飞兰州，再改乘汽车经平凉、邠州、到西安，于3月25日回到延安。
1940年5月10日（或11日），由于国内政治局势日趋险恶，国民党正酝酿发动第二次反共高潮，周恩来病愈后再次离开延安前往重庆，主持中共中央南方局的工作。5月13日到西安，21日离西安于31日到达重庆。后曾于7月27日飞抵延安参加了7月30日中央政治局会议，8月25日从延安经兰州飞重庆，此次留重庆的时间较长，于1943年6月28日离重庆返回延安参加整风运动。
中共中央南方局，以周恩来为书记，博古、凯丰、吴克坚、叶剑英、董必武为常委。南方局作为中共中央派驻重庆领导南方国民党统治区和部分沦陷区党的工作机构，直接领导四川、云南、贵州、湖北、湖南、广东、广西、江苏、江西、福建以及香港、澳门地区的党组织。由于国民党不允许共产党组织在其统治区内公开活动，因而南方局处于秘密状态，其领导人对外以中共代表或国民参政员的身份出面活动。南方局在周恩来等人的领导下，在国民党统治区极其复杂的情况下，高举抗日民族统一战线的旗帜，贯彻抗战、团结、进步的方针，卓有成效地开展了各项工作。南方局通过各种公开和秘密的渠道，争取抗日进步力量，用各种方式向广大群众宣传中国共产党的路线、方针和政策，为维系国共合作，巩固和扩大抗日民族统一战线，做了大量工作。
以周恩来为书记的南方局及其领导人，代表中共中央多次同国民党谈判，协商团结抗日的具体事宜。他们始终遵循坚持抗战反对投降，坚持团结反对分裂，坚持进步反对倒退的方针，对国民党顽固派反共反人民的活动，进行有理有利有节的斗争。比如抗战进入相持阶段后，国民党顽固派实行消极抗日，积极反共的政策，不断对我解放区制造磨擦，发动武装进攻，1941年1月发动了围歼新四军的“皖南事变”；在国统区大肆破坏我党组织，捕杀共产党人，迫害进步力量，使得抗日民族统一战线内部的矛盾多次激化。南方局根据党中央的指示，与他们进行了有理、有利、有节的斗争，争取了国内国际各方面力量的同情与支持，并配合解放区军民的奋勇反击，粉碎了国民党发动的三次反共高潮，迫使他们不得不坐下来谈判，保持了国共合作的局面。与此同时，大力加强了对国民党民主派、各民主党派、文化科技界、工商经济、地方实力派、海外侨胞等各方面的统一战线工作。在挽救民族危亡中，与他们风雨同舟，共同奋斗，发展壮大了进步势力，争取了广大中间势力，孤立了反共顽固势力。南方局还开展了国际反法西斯统一战线工作，得到国际舆论同情，广交了国外朋友。抗战胜利后，围绕毛泽东到重庆谈判和政治协商会议的召开，南方局又根据中央方针，发动和领导了国民党统治区的和平民主运动，进一步发展了人民的民主统一战线，为在国民党统治区形成第二条战线奠定了基础，为解放战争的胜利和新中国的建立创造了有利条件。